Calcolatrice di Ligazione

Categoria: Biologia
- April 04, 2025
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DNA Vettore

DNA Inserto

Impostazione della Reazione di Ligatione

Quantità Raccomandata dell'Inserto
8.3 ng
0.33 μL di stock dell'inserto
Quantità del Vettore
50 ng
Utilizzando 1 μL di stock del vettore
Rapporto Inserto:Vettore
3:1 (molare)
Ottimale per clonazione standard

Impostazione Completa della Reazione

Componente Volume (μL) Quantità Finale
DNA Vettore (50 ng/μL) 1.0 50 ng
DNA Inserto (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× Tampone per Ligasi DNA T4 2.0 1×
Ligasi DNA T4 1.0 400 U
Acqua priva di Nucleasi 15.67 Fino a 20 μL
Volume Totale 20.0

Consigli per l'Ottimizzazione

In base ai tuoi parametri di input, ecco alcune raccomandazioni:

  • Per estremità appiccicose 5' con un rapporto vettore:inserto di 1:3, incubare a 16°C per 4 ore.
  • Il trattamento CIP del vettore aiuterà a ridurre il background di auto-ligazione.
  • Se l'efficienza di trasformazione è bassa, prova ad aumentare il rapporto inserto:vettore a 5:1.
  • Per ligazioni a estremità smussate, aumenta la concentrazione di ligasi e prolunga il tempo di ligazione.
  • Inattiva la ligasi a 65°C per 10 minuti prima della trasformazione per i migliori risultati.

Informazioni sulla Ligatione del DNA

  • La ligazione del DNA comporta l'unione di frammenti di DNA attraverso la formazione di legami fosfodiestere.
  • La ligasi DNA T4 richiede ATP e Mg²⁺ per funzionare correttamente (forniti nel tampone di ligazione).
  • Le ligazioni a estremità appiccicose sono più efficienti delle ligazioni a estremità smussate.
  • I rapporti molari vettore:inserto variano tipicamente da 1:3 a 1:5 per la clonazione standard.
  • Rapporti inserto:vettore più elevati (3:1 a 10:1) sono raccomandati per ligazioni a estremità smussate o inserti più grandi.
  • La de-fosforilazione dei vettori (utilizzando CIP, SAP, ecc.) previene l'auto-ligazione del vettore.
  • I sistemi di ligasi rapida possono ridurre il tempo di ligazione a 5-15 minuti a temperatura ambiente.

Formula per la quantità di inserimento (ng):

\[ \text{Inserisci ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Dimensione dell'inserto in kb}}{\text{Dimensione del vettore in kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Moli dell'inserto}}{\text{Moli del vettore}} \right) \]

Che cos'è il Calcolatore di Ligation?

Il Calcolatore di Ligation è uno strumento che aiuta i ricercatori a determinare la quantità appropriata di DNA vettore e inserto necessaria per una reazione di ligazione di successo. La ligazione del DNA è un passaggio critico nel cloning molecolare, dove un inserto di DNA viene unito a un vettore plasmidico utilizzando un enzima chiamato DNA ligasi.

Come Funziona?

Questo calcolatore consente agli utenti di inserire dettagli sul loro vettore e inserto, inclusi lunghezza e concentrazione. In base al rapporto molare scelto, calcola la quantità necessaria di DNA dell'inserto per ottenere una reazione di ligazione ottimale.

Caratteristiche Chiave

  • Calcola i rapporti molari vettore-inserto per diversi scenari di cloning.
  • Supporta sia rapporti molari standard che personalizzati.
  • Fornisce raccomandazioni per le condizioni di ligazione basate su cloning a estremità adesive o smussate.
  • Include suggerimenti di ottimizzazione per migliorare l'efficienza della ligazione.

Come Utilizzare il Calcolatore

  1. Inserisci la lunghezza del vettore (bp) e la concentrazione (ng/μL).
  2. Inserisci la lunghezza dell'inserto (bp) e la concentrazione (ng/μL).
  3. Seleziona il rapporto molare vettore-inserto desiderato (ad es., 1:3, 1:5).
  4. Specifica il volume totale della reazione (ad es., 20 μL).
  5. Per impostazioni avanzate, scegli temperatura di ligazione, durata, tipo di ligasi e opzioni di trattamento del vettore.
  6. Clicca su “Calcola” per generare la quantità raccomandata di inserto e la configurazione della reazione.

Domande Frequenti

Qual è il rapporto molare ottimale vettore-inserto?

Per le ligazioni a estremità adesive, si raccomanda generalmente un rapporto vettore-inserto di 1:3 o 1:5. Per le ligazioni a estremità smussate, un rapporto più alto (ad es., da 1:5 a 1:10) può migliorare l'efficienza.

Perché si raccomanda la de-fosforilazione del vettore?

La de-fosforilazione (utilizzando CIP, SAP o Fosfatasi Antartica) previene la auto-ligazione del vettore, riducendo le colonie di fondo indesiderate.

Quali condizioni di ligazione dovrei utilizzare?

  • 16°C per 4 ore – Condizione standard per la ligasi T4 DNA.
  • Temperatura ambiente per 15 minuti – Adatta per la Ligasi Rapida.
  • Notte a 16°C – Raccomandata per ligazioni difficili o cloning a estremità smussate.

Come posso migliorare l'efficienza della ligazione?

  • Assicurati di avere il corretto rapporto molare per vettore e inserto.
  • Utilizza ligasi DNA e tampone freschi.
  • Ottimizza le condizioni di ligazione (temperatura e durata).
  • Conferma la presenza dell'inserto tramite elettroforesi su gel prima della ligazione.

Perché Utilizzare Questo Calcolatore?

Questo Calcolatore di Ligation semplifica la configurazione delle reazioni di ligazione del DNA, aiutando i ricercatori a determinare le giuste quantità di vettore e inserto per un cloning efficiente. Automatizzando i calcoli e offrendo suggerimenti di ottimizzazione, risparmia tempo e aumenta il tasso di successo degli esperimenti di ligazione.